心肌梗死（Myocardial infarction, MI），旧称心肌梗塞，在病理学上被定义为急性、持续性缺血、缺氧（冠状动脉功能不全）所引起的心肌坏死。MI 的症状包括心跳异常、不同程度的胸痛、也可能表现为手臂、背部或颈部的不适、呕吐、呼吸急促等。MI 可能会造成心脏衰竭、心律不整、心因性休克及心搏停止，往往导致严重后果。立即服用阿司匹林可防止凝血，舌下含服硝酸甘油可缓解 MI 发作时的胸痛。对于 MI 的诊断、治疗、预防以及相关基础研究层出不穷，其中，确定与 MI 相关的分子机制仍是科学研究的重点方向。
从机制上讲，MI 后 MicroRNA（miR）的诱导或抑制以细胞特异性方式触发下游事件，干扰内源性 miR 表达可能会调节整体心脏功能。例如，在 MI 下 miR-21 通过靶向 Smad7 促进心脏纤维化，而 miR-133 过表达则具有恢复心功能的治疗潜力。有研究表明 miR-322-5p 对肥厚心肌有保护作用，但其在 MI 中的具体作用机制尚未被证实。
2021 年 9 月 16 日，一篇题为“MicroRNA-322-5p Protects Against Myocardial Infarction through Targeting BTG2”的在预印本发表在 Research Square 上。该研究在 MI 大鼠模型中评估了 miR-322-5p 和 B 细胞易位基因 2（BTG2）的表达。将改变 miR-322-5p 或 BTG2 表达的腺病毒注射到 MI 大鼠中。接着，对靶向治疗后MI大鼠心肌组织中的心功能、炎症、心肌损伤、病理状况、细胞凋亡及 NF-κB 通路相关基因进行表达测定。实验表明，MI 大鼠心肌组织中 miR-322-5p 低表达，BTG2 高表达。恢复 miR-322-5p 的表达可改善 MI 大鼠的心脏功能，缓解炎症和心肌损伤，抑制病理状况和细胞凋亡，并致使 NF-κB 通路受阻。BTG2 的表达受 miR-322-5p 负调控，过表达 BTG2 抑制了 mir -322-5p 对 MI 大鼠的心脏保护作用。
为确认 MI 是否建模成功，进行了各种分析。超声心动图观察到大鼠 MI 建模后射血分数（EF）降低，左室舒张末期内径（LVIDd）和左室收缩末期内径（LVIDs）增加（图1A）。MI 大鼠术后促炎因子 TNF-α、IL-1β 和IL-6 以及心肌损伤标志物（LDH、CK-MB和cTnI）水平均升高（图1B-E）。此外，通过苏木精-伊红染色和马森三色染色观察 MI 术后大鼠心肌组织的病理变化，发现心肌严重损伤（图1F, 1G）。TUNEL染色显示 MI 模型大鼠心肌组织凋亡率增加（图1H）。通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹评估了 miR-322-5p 和 BTG2 的表达。结果显示，MI 术后大鼠的 miR-322-5p 水平降低而 BTG2 水平增加（图1I-K）。总之，MI 模型成功建立。
图1. MI 大鼠中 miR-322-5p 低表达，BTG2 高表达。
为揭示 miR-322-5p 在 MI 中的作用，研究人员将携带 miR-322-5p NC、miR-322-5p agomir 或 antagomir 的腺病毒注射到 MI 大鼠中。其中，miR-322-5p agomir 诱导 miR-322-5p 表达上调（图2A）。miR-322-5p 上调后，MI 大鼠心功能得到改善，促炎因子和心肌损伤标志物水平被抑制，病理状态得到缓解，细胞凋亡减少（图2B-I）。反之，miR-322-5p antagomir 处理降低了 miR-322-5p 的表达，引发了相反作用。总之，增加 miR-322-5p 缓解了 MI，而抑制 miR-322-5p 具有相反效果。
图2. 在大鼠中，恢复 miR-322-5p 可缓解 MI，而抑制 miR-322-5p 则会加重 MI。
根据 MI 大鼠中 miR-322-5p 和 BTG2 的表达趋势，推测 BTG2 是 miR-322-5p 的靶标。通过 targetscan 网站，发现了 miR-322-5p 和 BTG2 之间的结合位点（图3A）。荧光素酶活性试验表明，miR-322-5p agomir 转染后 BTG2-WT 荧光素酶活性降低（图3B）。通过 RIP 实验，检测到Ago2免疫沉淀后具有较高的 miR-322-5p 和BTG2表达（图3C）。
图3. BTG2 表达受 miR-322-5p 负调控。
为了进一步验证 miR-322-5p 与 BTG2 之间的靶向关系，在调节 miR-322-5p 后观察 BTG2 的表达变化。结果显示，MI 大鼠心肌组织在注射负载 miR-322-5p agomir 的腺病毒后 BTG2 表达降低，而在注射负载 miR-322-5p antagomir 的腺病毒后 BTG2 表达升高（图3D, 3E）。显然，BTG2 的表达受到 miR-322-5p 负向调控。
先前研究表明，抑制 NF-κB 通路可降低心肌细胞氧化应激和炎症因子的产生。在 MI 大鼠中，通过蛋白质印迹分析 NF-κB 通路相关基因表达。结果显示，MI 大鼠的 p-IKKα 和 p-IKKβ 蛋白表达增加，p-IKKα/IKKα 和 p-IKKβ/IKKβ 的比值增加。miR-322-5p agomir 处理后，NF-κB 通路相关基因的蛋白表达被逆转，而 miR-322-5p antagomir 对激活 NF-κB 通路具有促进作用（图4A, 4B）。显然，miR-322-5p 可抑制 NF-κB 通路。
图4. miR-322-5p 抑制 NF-κB 通路。
为进一步确定靶向 BTG2 的 miR-322-5p 影响 MI 的机制，将 miR-322-5p agomir + oe-NC 或 miR-322-5p agomir + oe-BTG2 腺病毒注射到 MI 大鼠体内。结果表明，在 MI 大鼠中，oe-BTG2 可恢复被miR-322-5p agomir 抑制的 BTG2 mRNA 的表达（图5A），损害心功能，加重炎症，增加心肌组织的病理损伤和凋亡，并升高 p-IKKα/IKKα 和 p-IKKβ/IKKβ（图5B-K）。
图5. 过表达 BTG2 抑制了 miR-322-5p 对 MI 大鼠的心脏保护作用。
该研究的主要结论是上调 miR-322-5p 可直接抑制 BTG2，降低促炎指标和心肌损伤标志物的水平，改善心脏功能，减缓心肌的受损情况并抑制细胞凋亡，赋予 MI 大鼠心脏保护作用，部分确定了 MI 的分子机制。该研究更新了关于 miR-322-5p/BTG2 轴调节的 MI 进展的知识，并为开发 MI 的潜在疗法提供了理论基础。其中，NF-κB 通路下游在该研究中没有得到充分探索，这是也是未来的重点研究方向。
文献链接：https://assets.researchsquare.com/files/rs-871695/v1/ea974b6e-c92b-4f55-b5db-9e23d7abc853.pdf?c=1631889640
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