角膜上皮是角膜的最外层，由存在于角膜缘上皮基底层的角膜上皮干细胞（corneal epithelial stem cells, CESCs）再生而来。CESCs 的主要功能是管理伤口愈合和平衡等过程，以维持角膜透明度。这些成体组织驻留干细胞占总角膜上皮的 3-5%，通常处于静止状态。然而，维持 CESCs 干性背后的分子机制仍不清楚，其中包括 microRNA（miRNAs）的表观遗传调节。
MicroRNAs（miRNAs）是一种内源性非编码 RNA 分子（约 18-24 个核苷酸），可靶向调节目标 mRNA 转录的蛋白质水平，而无需对基因序列进行任何修改。已知 miRNA 积极参与各种细胞过程，如增殖、分化、细胞代谢、体内平衡以及细胞凋亡等。先前的研究中，通过小 RNA 测序 将 CESCs 与分化的中央角膜上皮细胞进行比较。其中 hsa-miR-3168，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-143-3p，hsa-miR-150-5p，hsa-miR-10a-5p 和 hsa-miR-1910-5p 被确认在富集的 CESCs 中高表达，并通过 qPCR 进行了验证。根据锁定核酸原位杂交，发现 hsa-miR-143-3p 在角膜上皮的基底层表达，且仅在小细胞簇中表达，表明其可能与 CESCs 有关。
2022 年 7 月 6 日，印度泰米尔纳德邦卡拉伊库迪阿拉加帕大学的研究人员在 Scientific Reports 杂志上发表了题为“Hsa-miR-143-3p 抑制人角膜上皮干细胞中的 Wnt-β-catenin 和 MAPK 信号传导”的研究论文。该研究预测了 hsa-miR-143-3p 的靶基因，并进行了路径分析，以选择靶点进行功能研究。结果显示，hsa-miR-143-3p 抑制剂转染的细胞中 β-catenin、活性 β-catenin 和 ERK2 的表达高于对照组细胞，其局部核表达表明 Wnt 和 MAPK 信号的激活。因此，hsa-miR-143-3p 可能通过抑制 Wnt 和 MAPK 信号通路与 CESCs 的维持相关联。
对于 hsa-miR-143-3p，使用 mirWalk 和 mirDIP 分别鉴定了 1229 和 1661 个靶基因。共有 276 个共同靶基因被提交给 KEGG mapper，推测的靶基因被归入 231 条 KEGG 途径。这些通路包括 MAPK 通路、Wnt 信号通路、与干细胞多能性相关的信号通路以及 PI3K-AKT 等通路。其中，杂乱片段极性蛋白 3（DVL3）、赖氨酸乙酰转移酶 6A（KAT6A）、Kirsten 大鼠肉瘤 2 病毒癌基因同源物（KRAS）、丝裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）/ERK2 和丝裂原活化蛋白激酶 14（MAPK14）/p38 MAPK 是参与调节干细胞多能性的信号通路的五个靶标，它们被选择用于进一步分析。
hsa-miR-143-3p 模拟物和抑制物分别转染细胞后，与对照细胞相比，模拟物转染的细胞表现出 hsa-miR-143-3p 表达增加，抑制剂转染组则表现出表达降低（图 1a）。hsa-miR-143-3p 的五个选定靶标 mRNA 的表达在模拟物转染的细胞中下调，而在抑制剂转染的细胞中，它们的表达显著上调（图 1b）。同样，在蛋白质水平上，通过Western blot（图 2）和免疫染色（图 3），模拟物转染的细胞与对照组细胞相比，DVL3、KRAS、MAPK1 和 MAPK14 的表达减少。
图1. hsa-miR-143-3p 转染的细胞的 mRNA 表达情况。
在 mRNA 水平，与对照细胞相比，模拟物转染的细胞具有显著更高的干细胞标志物表达——（i）通用干细胞标志物 ABCG2，（ii）角膜缘干细胞标志物 p63α，（iii）胚胎干细胞标志物 OCT4、NANOG 和 KLF4（图 1C）。相比之下，分化标志物连接蛋白 43（Cx43）的表达在模拟物转染的细胞中降低。另一方面，在抑制剂转染的细胞中，干细胞标志物的表达降低而 Cx43 表达增加（图 1D、图 3）。模拟物转染细胞的共聚焦分析发现，与对照相比，ABCG2 和 p63α 双阳性的细胞数量显著增加。在抑制剂转染的细胞中，没有细胞同时表达 ABCG2 和 p63α（图 3）。Western blot 分析显示模拟物转染的细胞中 ABCG2 和 ΔNp63α 的表达水平上调，Cx43 的表达下调（图 2）。
图2. 在二维培养系统中生长的 hsa-miR-143-3p 转染的细胞的蛋白质表达情况。
与对照组相比，模拟物处理的细胞中 Wnt 信号调节因子 CTNNB1 和 AXIN2 的表达被下调，Wnt 信号转录抑制因子 TCF3 被上调（图 1E），而在抑制剂转染的细胞中则相反。在蛋白质水平上，免疫染色（图 3）和 Western blots 显示，β-catenin、活性 β-catenin 和 AXIN2 的表达在模拟物转染的细胞中减少。在抑制剂转染的细胞中，与对照组相比，β-catenin、活性 β-catenin 和 AXIN2 的表达增加（图 2）。MAPK信号调节因子p-ERK1/2、p-p38、p-c-JUN、p-c-FOS、p-ATF2 和 p-p53 在模拟物转染的细胞中被下调，在抑制剂转染的细胞中被上调（图 2）。
图3. hsa-miR-143-3p转染的细胞中蛋白质表达的定位。
为了确认转染培养物中干细胞的存在，进行了集落形成试验。与对照组和抑制剂处理的细胞相比，模拟物处理的细胞显示出更高的菌落形成效率百分比。此外，与对照组相比，全克隆样集落的百分比也有显著增加。抑制剂处理的细胞没有产生这种较大的集落（图 4）。因此，hsa-miR-143-3p 的高表达增加了集落形成的效率，并支持全克隆样集落的形成。
图4. hsa-miR-143-3p 转染的细胞的集落形成潜力。
在 3D RAFT TEs 上生长的原代角膜上皮细胞，在转染模拟物后以下蛋白的表达均减少 ——（i）hsa-miR-143-3p靶标：DVL3、KRAS、MAPK1 和 MAPK14；（ii）分化标志物：Cx43；（iii）Wnt 信号调节因子：AXIN2、β-catenin 和活性 β-catenin；（iv）MAPK信号调节因子：p-ERK1/2、p-p38、p-c-JUN、p-c-FOS、p-ATF2 和 p-p53。然而，与对照组相比，干细胞标志物 ABCG2 和 ΔNp63α 在模拟物转染的细胞中表达增加（图 5）。在模拟物转染的细胞中，β-catenin、活性 β-catenin 和 ERK2 的阳性仅限于细胞膜内。但在抑制剂转染的细胞中，膜和细胞核都有阳性反应，表明存在核转位（图 6）。
图5. 在三维 RAFT 培养系统中生长的 hsa-miR-143-3p 转染的细胞的蛋白质表达。
图6. β-catenin、活性 β-catenin 和 ERK2 在三维 RAFT 中转染的细胞中的表达定位。
近期的研究在各种干细胞中已经发现了 miRNAs 的重要调节作用。MiRNAs 通过选择性地靶向所涉及的分子来调节信号通路。虽然 hsa-miR-143-3p 的表达在各种眼部组织中被确认，但其功能关联尚未被探知。在该研究中，异位表达的 hsa-miR-143-3p 增加了培养的角膜上皮细胞的集落形成潜力，同时基于大小和形态全克隆样集落的数量增加。此外，在模拟物转染的细胞中，干细胞标志物的表达增加，而分化标志物的表达减少。因此，这些结果共同表明，hsa-miR-143-3p 与维持 CESCs 的干性有关。先前有报告指出 Wnt 和 MAPK 信号与干细胞的维持和分化有关。实验发现，Wnt 信号调节因子和 MAPK 信号调节因子的表达均在模拟物转染细胞中下调，表明 Wnt-β-catenin 和 MAPK 信号传导受到抑制。接下来还需要进行功能研究，对于确认预测基因是否是 hsa-miR-143-3p 的直接靶标及其在维持干性中的作用至关重要。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41598-022-15263-x
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