随着人口老龄化情况的加剧，关于肌肉骨骼疾病的研究越来越具有重要临床意义。以关节炎为例，常致使患者关节肿胀、疼痛，并导致运动障碍，严重影响生活质量。其中类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种全身炎症性自身免疫病，表现为双手掌指关节和腕关节等小关节为主的对称性、持续性多关节炎，病理特征在于滑膜处的间歇性炎症，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。在过去的十年里，关节炎研究逐渐从传统的二维细胞培养转向更复杂的三维细胞培养，这允许更多的生理相关的相互作用应用于体外人类关节炎滑膜组织的研究转化。
2021 年 9 月 7 日，维也纳医科大学的联合科研团队在 Lab on a Chip 杂志上发表了题为《基于人体三维芯片的软骨-滑膜共培养联合模型的建立，用于关节炎研究中的相互串扰研究》的预印本。该研究建立了一个基于芯片的三维组织共培养模型，模拟个体滑膜和软骨类器官之间的相互串扰。当与滑膜类器官共培养时，发现软骨类器官能够诱导更高程度的软骨生理和结构，并显示出不同的细胞因子反应，该结果突出了组织水平相互串扰在关节炎疾病建模中的重要性。
成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes, FLS）是 RA 研究中的主要滑膜细胞类型。在健康滑膜中，FLS 通过产生润滑素或乙酰透明质酸来润滑关节，维持内稳态和功能。此外，FLS 还负责滑膜内衬的形成和内部关节膜的维持（图1A）。RA发病和发展过程中，FLS 受到激活和迁移的免疫细胞如巨噬细胞、B细胞和T细胞分泌的细胞因子（如IL-1β、TNFα、IL-6、IL-17）的刺激，进而也分泌细胞因子（如IL-6、IL-15、IL-23）、趋化因子（如IL-8、CXCL12）和降解酶（各种金属蛋白酶和组织蛋白酶）。此时，IL-6 是一种促进关节炎症和破坏的中枢促炎分子。迄今为止，大多数关节炎研究系统都依赖非人类或永生化细胞系来建立复杂的 3D 共培养物，对于模拟人类关节炎过程的预测能力较差。因此，该研究提出了一种基于空间分离共培养的三维人关节芯片模型，以了解滑膜和软骨类器官之间的组织交互串扰如何刺激关节（病理）生理（图1B）。
图1. A） 影响膝关节滑膜软骨和软骨下骨的滑膜活动示意图。B） 基于类器官的关节芯片共培养系统，包括软骨和滑膜隔室，用于相互炎症串扰。
首先，对单个水凝胶室分别进行研究，以探究每个类器官单元的形成和成熟。在滑膜类器官培养中，RA 患者来源的原代 FLS 在注射前混合到 Matrigel 中培养 4 周。值得注意的是，在滑膜类器官形成过程中，发生了显著的水凝胶凝结和重塑。图 2A 显示了水凝胶体积的增加（腔室高度从 1 mm 增加到 4 mm，体积从 19.6 μl 增加到 78.5 μl）对聚合行为的影响，其中 RA-FLS 类器官体积在 28天 后逐渐下降到 18-36% 之间。图 2B 显示了在整个 28 天的培养期间，滑膜类器官形状从矩形到球形的时间依赖性变化，这表明随着 FLS 类器官的成熟，球形度逐渐增加。在早期的生物芯片设计中，当类器官紧密地接触时，它们会形成直接连接并允许 FLS 向软骨单元迁移。由于目前生物芯片设计的目标是在没有细胞间直接相互作用的情况下实现相互的分子串扰，因此需要对类器官定位和成熟进行更可重复的空间控制。如图 2C 所示，该研究评估了滑膜类器官相对于水凝胶锚（上图）和腔室中心（下图）的类器官定位精度。
图2. RA 患者来源的 FLS 形成类器官的滑膜器官芯片的性能评估。
接着，将片上滑膜聚合动力学与 polyHEMA 涂层抗粘连孔板（MMC）进行比较。结果如图 3A所示，二者具有类似的整体架构特征，且类器官生物芯片具有显著更高的再现性，此外，形态测量分析显示滑膜微团与生物芯片类器官的滑膜网络形态相似，各参数随时间逐渐增大（图3B-3D）。
图3. 与 FLS 类器官芯片相比，浮在孔板上的 FLS 微型类器官的形态分析。
除了 FLS 外，关节炎滑膜组织还包括多种免疫细胞，如巨噬细胞、B 细胞和 T 细胞。虽然已知标准 2D 单一培养条件会使用 DMEM 培养基快速消耗免疫细胞，从而产生纯 FLS。于是，接下来研究了用于类器官芯片培养和 2D/3D 培养的培养基组成对免疫细胞存活的影响。图 4A 显示，当用白细胞培养基（如 RPMI 1640）代替 DMEM 培养基时，白细胞存活率更高，导致接种后第1至2周的 T 细胞、巨噬细胞和 B 细胞亚群分别增加 4.9 倍、2.4 倍和 1.8 倍。此外，滑膜类器官芯片培养进一步提高了两种培养基类型的白细胞存活率，与 2D 培养相比，白细胞数量分别增加了 11 倍和 20 倍（图4B）。这意味着类风湿关节炎患者体内的免疫细胞的数量和类型存在显著差异，需要在体外关节炎模型中能够正确体现。对于 FLS 2D 培养，免疫细胞耗损降低了关节炎样本在细胞组成和细胞因子分泌方面的异质性，而有利于 FLS 的生长。本研究构建的基于芯片的滑膜器官系统具有三维组织样微环境，即使在不利的培养基（如DMEM）中，也能保护滑膜白细胞种群免于耗尽。
图4. 培养基类型以及 2D/3D 培养对滑膜类器官内白细胞数量的影响。
随后，研究了传代对类器官形成和细胞因子分泌的影响。在五周内培养了基于芯片的滑膜类器官，并分析了重要的类器官参数，包括面积、实心度、周长、圆度和每单位类器官的数量（图5）。结果显示，早期传代（p1）形成较小的细胞聚集体的趋势，而由 p5 细胞形成的 FLS 类器官产生了更大的可重现类器官区域。其余的形态测量参数，包括周长、圆度和实心度，也同样表明在较高传代数（p3-4）下可重现性最高。此外，在传代 4-5 周后，该系统在每个类器官隔室中形成单个类器官的可重现性得分最高。这些参数测定结果表明 FLS 种群的传代提高了类器官形成的可重复性。
图5. 5 周内基于芯片的滑膜类器官形成的形态测量。
在 3D 环境中对原代细胞进行芯片上培养以可保留和分泌更多天然组织样分子，因此，接下来监测了 FLS 类器官在增加传代和培养时间点的分泌行为。图 6A-6D 显示了直至传代 p5 和接种后第 3 周的 IL-6、IL-8、MMP-13 和 VEGF 分泌情况。FLS 类器官在第 1 周显示出较高的总体分泌能力，在培养三周内显著下降，与传代数或分子类型无关。FLS 类器官早期分泌活性的传代依赖性差异很可能不是单独由免疫细胞耗竭引起的，因为免疫细胞的数量、特定的分泌分子（白细胞介素或 MMPs）之间没有直接的相关性。此外，活化的 FLS 具有较高的分泌能力。这意味着其他因素，如炎症记忆或分离前的重新编程更有可能影响 RA-FLS 在 3D 培养中类器官形成过程中的反应和成熟。
图6. FLS 在接种后第 7 天和第 28 天产生的滑膜类器官的分泌分析。
接着，研究了生物芯片培养以及基质刚度/组成对软骨细胞表型的影响。共聚焦成像证实了播种后纤维蛋白构建体中关节软骨细胞的典型圆形形态（图7A），接种后第 21 天软骨细胞存活率达 83.46 ± 16.5%（见图 7B 和 7C）。进一步的组织学比较（图7D）揭示了基于芯片的软骨类器官可以概括人类关节软骨表层组织区域的形态和细胞密度特征，这些特征主要受机械磨损和蛋白酶降解的影响。此外，来自单个健康供体样本的软骨类器官显示软骨健康指标 Col II/Col I 和 AGC/Col I 的比值与天然人类软骨中发现的值相似（图7E）。总体而言，这些结果表明，就体外纤维蛋白包埋软骨细胞的天然组织样特性而言，这些结果与先前的研究非常一致。
图7. 软骨类器官芯片模型评估。
该研究首次建立了基于患者自组织源细胞的软骨-滑膜双类器官芯片模型，该模型允许研究骨科/关节炎研究中的组织相互串扰。由于具有微流体设计特征，当前的微流体关节芯片能够可靠地形成具有高重现性和定位精度的类器官，这为生物医学领域提供了重要的体外分析系统。
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/LC/D1LC00130B
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