近年来，源自成人和多能干细胞的类器官已作为体外模型系统崭露头角，这种体外模型可以再现生理学的关键特征，并应用于药物筛选和再生医学。源自人类多能干细胞（hPSC）的类器官能够重现人类胚胎发育的关键特征，为人类早期发育研究提供了前所未有的视角。但是，它们在尺寸可重复性和复杂性方面受到限制。此外，这些类器官没有内在的血管化，这对它们的持续生长以及理解血管在形态发生中的作用构成了重大挑战。
类器官血管化的早期尝试集中在将这些类器官移植到鼠宿主中。其中，肠道和大脑类器官被证明可以很好地融入宿主并成熟，宿主血管系统侵入类器官，然后建立功能性灌注血管网络。这些观察结果强调了血管系统在人类类器官发育中的重要性，但使用具有内源性血管系统的体内宿主显然不是类器官血管化的实用方法，这促使研究人员在体外进行了许多血管化尝试。最常见的方法涉及类器官的共培养，包括肝脏、胰腺、结肠、肾脏和大脑类器官与原发性内皮细胞（EC），其中最常用的是人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。然而，目前的类器官血管化策略目前尚不能确保与体内类似的早期共同发育所需的时间同步性和空间定向。
2022 年 3 月 25 日，来自比利时鲁汶大学的研究团队在 Lab on a Chip 杂志上发表了题为“使用 3D 打印微流控芯片设计神经血管类器官”的研究论文。该研究开发了一种基于人类多能干细胞（hPSC）的方法来生成类器官，这些类器官以空间确定的方式与血管细胞相互作用。类器官和血管系统之间的空间相互作用是通过使用定制设计的 3D 打印微流控芯片实现的，该芯片允许顺序和发育匹配的共培养系统。芯片上的 hPSC 衍生的周细胞和内皮细胞发芽并自我组装成有组织的血管网络，并使用脑器官作为模型系统来探索与这种新生成的血管的相互作用。在共同开发后，血管细胞与大脑类器官发生物理相互作用，并在芯片上形成集成的神经血管类器官。在共同发展的过程中，血管细胞与大脑类器官进行物理互动，并在芯片上形成一个综合的神经血管类器官。使用该平台，可以为了解和操纵组织特异性类器官与血管的共同发展开辟新的途径。
为了应对类器官和血管系统之间时间和空间同步的挑战，研究人员开发了一种基于两个关键方面的方法：使用全 hPSC 衍生的细胞谱系和开发定制的 3D 打印来设计具有特定几何形状的微流体芯片。假设通过同时启动 PSCs 的血管和神经分化，将获得发育匹配的谱系，然后可以在仿生芯片上以空间定义的方式生长（图 1A）。该微流控芯片的一个关键特征是其“开孔”设计，与培养室封闭的常用微流体芯片相比，这种设计在主培养室上没有任何物理密封，允许直接和精确地将类器官放置在中央隔室中，并容易将其取出进行下游分析。该设计的另一个优点是可以在每个芯片中播种单个类器官，使其成为研究单个类器官共同发育过程的理想平台。
图1. 用于芯片上血管化类器官培养的 3D 打印微流控平台。
为了支持血管细胞出芽、网络形成和血管侵入芯片上生长的类器官，开孔微流体芯片的设计使得中央类器官室两侧的微流体通道可以通过入口接种血管细胞（图 1A、1B）。通过通道和主隔间几乎完整的壁确保了类器官室隔室和微流体通道之间的可扩散分子和细胞的连通，在盖玻片和 3D 打印微流体芯片之间仅留有 50 μm 的间隙（图 1B 下图）。为了使芯片适用于显微镜，该设计是一种无底芯片（图 1A），在随后的步骤中，使用生物相容的紫外线固化胶水将玻璃盖玻片永久固定在其底部（图 1C）。利用 3D 打印技术的设计灵活性，研究人员还优化了芯片制造流程，使得能够在一天内处理数十到数百个芯片（图 1C）。为了使这些芯片内实验的处理和图像采集并行化，使用了廉价、低分辨率的聚乳酸（PLA）塑料熔融沉积建模打印来制造能够容纳 6 个微流体装置的板。这种多路复用平台有助于以标准化和可重复的方式进行芯片生物学实验。
为了产生芯片的血管部分的细胞，研究人员的目标是同时生成 ECs 和周细胞。最近发布的协议证明了 hPSCs 以 3D 血管类器官的形式定向分化为双重 EC 和周细胞。为了快速获得用于微流控芯片播种的大量血管细胞，研究人员将此方案应用于 hPSC 2D 单层，进行 6 天的分化（图 2A）。为了确认该分化方案产生能够同时产生 ECs 和周细胞，在分化的第 6 天进行了免疫组织化学（IHC）和基因表达分析，证实了由 PDGFRβ 标记的周细胞和由 CD31 标记的 ECs 的存在（图 2A）。此外，基因表达分析显示，与未分化的 hPSC 相比，早期 EC 标志物 CD34、后期 EC 标志物 CD31、CDH5 和 KDR，以及周细胞标志物 PDGFRβ 和 CD73 皆明显上调，而多能性标志物 NANOG 和 SOX2 被下调。然后将这种混合的血管细胞群接种于微流控芯片的通道。
图2. 3D 打印微流控芯片上的血管网络。
为了提供 3D 血管侵袭的基质，使用基质胶填充中央类器官室，基质胶是一种常用于血管生成出芽测定的细胞外基质。在第 7 天通过 IHC 观察到芯片上的 EC 和周细胞都出芽，最初接种在微流体通道中的血管细胞开始通过中间区域出芽到类器官培养室中（图 2B）。到分化的第 10 天，在类器官培养室中可观察到这些血管细胞，并逐渐向类器官培养室的中心出芽（图 2C）。这些血管芽的长度从它们首次出现在类器官培养室中的那一天（出芽第 1 天，sD1）开始测量了 6 天，可以看到在这个观察期内，它们的长度不断增加（图 2C），经过计算为平均每天 80 μm。为了确定周细胞和 ECs 是否会在较长的分化期内保持其特性，在第 15 天和第 30 天对 PDGFRβ 和 CD31 进行染色，结果证实了血管组织的明显差异（图 2D，2E）。在第 15 天，周细胞和 EC 具有混合和无序的外观，位于同一平面上（图 2F 上图）。相比之下，到第 30 天，血管网络得到了进一步发展，CD31+ 细胞有助于巩固血管样结构，且周细胞不再与 EC 位于同一平面，而是在形成的血管网络上方形成支撑层（图 2G）。
接下来评估血管和脑类器官是否可以在芯片上一起进行培养。该研究开发了一种分化同步方案，血管分化和脑类器官分化都将在芯片外启动，随后在早期发育时间点上将其集中到芯片上。该方案包括在分化的第 5 天将脑类器官播种到类器官培养室中，在分化的第 6 天将血管细胞播种到微流体通道中（图 3A）。通过这种方式，共分化将发生得不早不晚，允许单独的胚层规范以及脑特异性内皮规范。在这些条件下，两种培养物都表现出良好的存活率，在中心隔室中有特征性的类器官生长，并且从通道中长出血管（图 3B）。单一和共培养系统之间的出芽长度相似，表明血管细胞和类器官之间的相互作用没有改变出芽特征（图 3C）。共同培养的脑类器官的大小与没有血管生长的类器官没有明显差异，这表明血管的增加并不妨碍类器官的生长（图 3D）。基因表达分析显示，与单体脑培养物相比，未成熟神经元 TBR1 和深层神经元 CTIP2 的标记物在共培养物中的表达量分别降低了 2.7 倍和 5.5 倍（图 3E）。相比之下，神经祖细胞标志物 SOX2、NES 和 PAX6 在共培养系统中的表达水平与仅孕育脑器官的芯片相比没有明显变化。值得注意的是，EC 和周细胞标志物 CD34、CD31、KDR、CDH5 和 NG2 在芯片共培养系统中被高度上调（图 3F）。
图3. 神经血管共培养芯片。
为了更好地了解芯片上脑类器官的成熟度和发育动态，研究人员在分化的 D15 和 D30 对单脑培养和共培养的未成熟的神经元标志物双皮质素（DCX）和成熟的神经元标志物神经核（NeuN）进行了染色（图3G）。在 D15 的单培养和共培养条件下，DCX 和 NeuN 的表达都位于类器官的外层，在更不成熟的心室区样类器官核心中缺乏这些标志物。与 D15 时混合的 NeuN 和 DCX 表达相比，D30 时更多成熟的 NeuN+ 神经元出现在类器官的外部，更多未成熟的神经元靠近核心。在 D15 和 D30 的共培养条件下，观察到显著更高的 NeuN+ 细胞丰度，表明由于血管细胞的存在而成熟速度更快。
为了进一步表征初始共培养期间神经和血管细胞的分子特性和定位，在分化的第15天，即在芯片上共培养 9 天，对神经血管构建体进行了染色（图 4A）。βiii-TUBULIN+ 有丝分裂后的神经元、CD31+ ECs 以及 PDGFRβ+ 周细胞在第 15 天都出现在共培养物中，表明共培养物是允许这些关键细胞类型共同分化的。分析 3D 共聚焦图像的各个切片，观察到 ECs 位于微流控芯片底部附近，而周细胞和神经元则位于板底部上方约 40 μm 处（图 4B）。与 EC 相比，周细胞与类器官更紧密地接触，随后迁移出类器官。可以看到由类器官内假定的神经嵴样细胞池产生的单独的周细胞群从类器官的外围向外迁移。为了验证该平台可以维持类器官和血管系统之间的长期相互作用，研究人员将共培养物维持到分化 30 天。引人注目的是，从神经血管类器官的中央体发出的 βiii TUBILIN + 神经突常与血管网络对齐（图 4C）。共聚焦图像的 3D 重建显示，神经突不仅与内皮网络对齐，而且还从类器官下降，以便与微流体装置底部的血管网络接触（图 4D）。
图4. 神经血管共培养芯片上的血管发育。
3D 可视化还显示，这些血管网络与 PDGFRβ+ 的周细胞形成了一个相邻的层，表明建立了一个复杂的图案结构，将周细胞、内皮细胞和大脑类器官联系起来。在分化后期观察到显著的表型变化，包括持续的类器官生长伴随着血管网络的显著扩张和巩固。为了更精准地量化单血管和共培养条件下脑类器官内外血管系统的存在和复杂性，研究人员评估了仅有血管和共培养条件下的血管面积、平均血管长度和连接密度，并发现血管网络在两种情况下具有相似的特征（图 5A）。此外，在共培养类器官中，83% 的内皮细胞侵入类器官边缘，并在 42% 的类器官中穿透了类器官核心（图 4C，5B）。
图5. 3D 打印微流控芯片中的血管网络表征和类器官侵袭。
为了评估芯片上生成的血管网络的可灌注性和渗透性，在第 20 天和第 25 天对神经血管共生体进行了主动灌注（图 6A）。在主动灌注 fluorescein-40kDa 葡聚糖后不久，血管网络内出现了强烈的荧光信号，其迅速扩散到血管结构周围的凝胶中（图 6B，6C）。与 fluorescein-40kDa 葡聚糖相比，较大的 1 μm 红色荧光（RF）-珠子可以在单个血管内被追踪到，并且不会渗漏到周围的凝胶中（图 6D-D′）。总之，这些结果证明了在微流控芯片内生成的血管网络的功能以及它们在测试小型、膜扩散性化合物方面的潜在适用性。
图6. 3D 打印芯片上的可灌注血管网络。
hPSC 衍生的类器官和血管系统之间的芯片上相互作用的产生为开发复杂的神经血管单元提供了巨大的希望，这将能够更精确地研究 ECs 和周细胞在人体组织发育以及疾病中的作用，以及使用患者特定的 hPSC 进行疾病模型的应用。该研究首次展示了通过使用 hPSC 和微流体技术来控制内皮细胞、周细胞和类器官的物理相互作用的可能性，以实现在时间和空间上高度同步的类器官血管化过程。在这个平台上观察到的血管生成的出芽和网络的形成，其大小和分支结构与已经报道的初级周细胞和 ECs 相似。此外，该研究结果还显示，单脑培养和共培养之间的发育动态有明显差异，与单体培养相比，共培养的分化速度加快。该研究展示的类器官血管化方法被设计为通用和广泛适用，为体外组织血管化领域的进一步研究开辟了新的途径。
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/lc/d1lc00535a#cit19
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