营养摄取和代谢途径活性的控制是维持肠道稳态以及肠道干细胞和祖细胞行为所必需的。特定的癌症相关突变使细胞获得和代谢有利于增殖的营养物质，而不是有效地产生三磷酸腺苷（ATP）。乳酸、葡萄糖和谷氨酰胺作为氧气和 pH 值的上游调节剂，被认为是重要的肿瘤代谢物，即使在有氧气的情况下，肿瘤细胞也会吸收大量的葡萄糖并产生大量的乳酸。这个过程也被称为“Warburg 效应或有氧糖酵解”。因此，人类肿瘤之间和内部的代谢异质性对开发抗癌疗法提出了相当大的挑战。
此前几项研究报告称，肿瘤周围的无组织肿瘤区域与非肿瘤的健康组织存在许多形态学和表型差异，包括 pH 水平、等位基因失衡、端粒长度、以及转录组和表观遗传畸变。然而，人们对控制肿瘤代谢物的分子机制知之甚少，特别是在紧邻肿瘤的区域促进肿瘤组织所需的代谢改变而调节的肠道 miRNAs。因此，阐明在这些不同细胞和组织中协调细胞转化的分子机制可能会回答有关早期肿瘤形成的关键生物学问题，并导致确定新的治疗靶点。
2022 年 1 月 19 日，英国诺丁汉大学医学院的研究人员在 Oncogenesis 杂志上发表了题为“抗 miR-135/ SPOCK1 轴拮抗代谢对肠/结肠肿瘤类器官药物反应的影响”的研究论文。该研究旨在通过双突变小鼠肠/结直肠癌（colorectal cancer, CRC）模型研究小鼠十二指肠息肉和非息肉衍生的类器官（mPO 和 mNPO）中失调的 miRNA 与代谢成分之间的关系。研究分析了 mPO 和 mNPO 中 373 个 miRNA 和 12 个失调代谢基因的表达，结果显示 miR-135b 可能靶向 Spock1。SPOCK1 的上调与 CRCs 的晚期相关。miR-135b 的敲低降低了 CRC 患者来源的肿瘤类器官（CRC tPDO）中 SPOCK1 的表达水平、葡萄糖消耗和乳酸分泌。由 miR-135b 过表达诱导的 SPOCK1增加促进了 Warburg 效应，从而促进了 5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用。因此，与 miR-135b 反义核苷酸的联合可能代表一种新的策略，使 CRC 对基于化学试剂的治疗敏感。
腺癌是最常见的小肠癌类型，这些肿瘤大多发生在十二指肠，是小肠中离胃最近的部分。因此，为了一致地分析来自息肉和非息肉切片的葡萄糖和乳酸代谢谱，研究人员首先从 Apc Min Fbxw7 ΔG 双突变小鼠（小肠和大肠腺瘤快速发展）中解剖的十二指肠组织中分别培养出息肉和非息肉类器官（图 1A、1B）。为了排除 Wnt3a 和 Noggin 对十二指肠 mNPOs 和 mPOs 培养中细胞代谢的可能影响，在 mNPOs 和 mPOs 培养中都包括分泌的 Noggin。接下来，测量了初级（第一段）类器官中的葡萄糖和乳酸的浓度（图 1C，1D）。通过该分析，确定了十二指肠 mNPO 和 mPO 代谢之间的巨大差异。与 mNPO 相比，mPO 的葡萄糖消耗率（图 1C）和乳酸生成（图 1D）显著更高，这表明代谢转向无氧糖酵解的以维持 mPOs 较高的生长速度和新癌细胞的产生。
图1. 小鼠十二指肠 Apc Min Fbxw 7 ΔG 息肉衍生的类器官（mPO）与非息肉衍生的类器官（mNPO）培养物相比，显著增加了葡萄糖消耗和乳酸产量。
为了验证从上述代谢测定中获得的结论，通过 qRT-PCR 分析了一组 12 个代谢基因的 mRNA 表达，这些基因在小鼠突变的 Apc 肿瘤中被报道为高度失调。所选的基因涉及细胞代谢（葡萄糖、活性氧、脂肪酸的吸收和组织重塑）。结果显示，mPOs 中 Aldob、Cyba、HexII、Fabp6、Slc2a5 和 Spock1、Spock2 的表达水平上调，而 G6pc、Slc2a1 和 Slc2a2 下调，但 Ephx2 和 Gstt1 在 mPO 与 mNPO 中没有变化（图 2A）。SPOCK1 和 SPOCK2 蛋白表达的蛋白质印迹分析证实了在 mRNA 水平上观察到的诱导。SPOCK1 和 SPOCK2 蛋白（图 2B、2C）。这些数据表明，十二指肠 mNPO 和 mPO 细胞之间存在差异的葡萄糖/乳酸改变和代谢基因表达。SPOCK1 携带乙酰肝素和硫酸软骨素链，相比之下，SPOCK2 是一个纯硫酸乙酰肝素蛋白多糖，这表明每个 SPOCK 都有特定的生理作用。SPOCK1 是 TGF-β 的正向下游调节因子，其表达通过 Wnt/β-catenin 途径进行调节。除了生理功能外，SPOCK1 还是包括 CRC 在内多种癌症的关键调节因子，因此，SPOCK1 是癌症进展的关键调节因子。
图2. 小鼠十二指肠Apc Min Fbxw 7 ΔG -POs 培养条件与十二指肠 Apc Min Fbxw 7 ΔG -NPOs 的比较，影响肠道类器官细胞表达选择的代谢基因。
如上所述，除了转录因子的异常活性外，其他调节因子，包括 miRNA，可同时与突变 APC 和 FBXW7 细胞中的代谢基因表达及其活性改变有关。使用 miRCURY LNA miRNA 测定法在十二指肠 mNPOs 和 mPOs 培养物之间进行了 miRNA 表达谱的比较（图 3A）。同时排除了从不同胎次发育的相同类器官类型中差异表达的 miRNA（图 3B、3C）。接着鉴定了几种与癌症相关的 miRNAs，与 mNPO 相比，它们在 mPO 中的表达存在差异。包括 let-7 家族成员在内的几种 miRNAs 显著下调，mPO 与 mNPO 中 13 种过表达 miRNAs 的显著上调（> 3 倍）（图 3A、3D）。这些上调的 miRNA 是：miR-128、miR-135b、miR-136、miR-25、miR-367、miR-26a、miR-425、miR-210、miR-141、miR-30e、miR-103、miR -302 和 miR-682（图 3D，红色）。
图3. ApcMin Fbxw 7ΔG -NPOs 与 Apc Min Fbxw 7 ΔG -Pos 中 miRNA 表达倍数变化的比较。
接下来使用 TargetScan 网络服务器探究了在 mPOs 与 mNPOs 中过表达的 miRNAs 是否是上述代谢基因的系统性靶点。结果发现，在上述基因中，Spock1 是 miR-135 的潜在靶标，并且，Spock2 是 miR-26a 和 miR-141 的潜在靶标。此外，发现 SPOCK1（图 4A）而不是 SPOCK2（图 4B）的表达增加与人类结肠腺癌（colon adenocarcinoma, COAD）的总生存率（OS）不佳有关。进一步的阶段性分析表明，SPOCK1 的表达在 COAD 癌症的各个阶段都有所提高，相对而言，晚期的表达最高（图 4C）。
图4. SPOCK1 在晚期 CRC 和 CRC tPDO 中高度表达。
接下来，研究人员测试了患者衍生的类器官（patient-derived organoids , PDO），因为它们代表了临床相关的平台。分别培养了肿瘤患者衍生的类器官（tPDO）和邻近的健康患者衍生的器官（hPDO），进行 qRT-PCR 分析以研究 CRC PDO 中 miR-135b 和 SPOCK1 的相对表达水平。结果发现，SPOCK1 mRNA 的表达（图 4D）和 CRC tPDO 中的 miR-135b 表达水平显著高于 CRC hPDO（图 4E）。
为了研究 miR-135b 对 SPOCK1 表达水平的调节作用，用对照载体慢病毒（Control）或 miRZip-135b（anti-miR-135b）慢病毒转导了 tPDO。验证了抗 miR-135b 可显著降低 CRC tPDO 中 miR-135b 的水平（图 5A）。为了确认 miR-135b/SPOCK1 轴影响 tPDO 中的代谢，我们测试了重要的肿瘤代谢物的浓度：用抗 miR-135b 处理的类器官培养基中的乳酸和葡萄糖。发现抗 miR-135b 可减少葡萄糖消耗和乳酸产生（图 5B、5C）。此外，为了确认 miR-135b/ SPOCK1 转录调控轴，我们插入了野生型或突变体 3'UTR SPOCK1（图 5D），进入报告构建体（pEZXMT06 载体），然后进行双荧光素酶报告分析。我们发现与抗 miR-135b 共转染显著抑制了含有野生型 SPOCK1 3'-UTR-reporter 但不包含突变型 SPOCK1 3'-UTR-reporter 的细胞的荧光素酶活性（图 5E）。此外， SPOCK1 和SPOCK 2 表达的 qRT-PCR 分析通过抑制 CRC tPDO 中的 miR-135b 表达，证实了抑制 SPOCK1 对 mRNA 水平的特异性（图 5F）。我们证明了 SPOCK1是 miR-135b 的靶标，用 miR-135b 治疗能够降低 SPOCK1 的表达。
图5. miR-135 靶向SPOCK1 基因影响 CRC tPDO 中的葡萄糖摄取和乳酸产生。
关于 SPOCK1 在肿瘤细胞外基质（ECM）动态稳态过程中的作用有大量信息，它激活了许多分子信号通路（如 EMT 过程、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt 和 mTOR/S6K 信号通路）。然而，需要进一步的研究来探讨这种蛋白质是否作为癌症的潜在治疗靶点。最近的一些研究表明，敲低 SPOCK1 可在体外和体内抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭。值得注意的是，先前在 CRC 细胞系和 CRC 患者血清中报道了 miR-135b 的显著上调。因此，对抗 miR-135b 表达的 tPDO 进行了 5 -FU 细胞抑制剂和形态学检测（图 6A）。结果发现，与 miRZip-135b 的联合处理使 tPDOs 细胞对 5-FU 诱导的细胞抑制作用敏感（图 6A、6B），并且抑制 SPOCK1 基因表达（图 6C）。
图6. 敲低 miR-135b（miRZip-135b）使 CRC tPDO 和细胞对 5-FU 诱导的细胞抑制和细胞毒性敏感。
此外，研究人员通过 SRB 比色法评估了人 APC 突变的结肠直肠癌细胞系 DLD-1 与 CCD-841 正常结肠细胞在用 10 次增加剂量的 5-FU ± anti-miR-135 处理后的存活率 （图 6D）。结果表明，与 CCD-841 - anti-miR-135 细胞相比，5-FU 在 DLD-1 - anti-miR-135 中表现出更大的细胞毒性，而 miR-135b 敲低（+ anti-miR-135）对结肠癌 DLD-1 细胞的敏感性高于非癌性（CCD-841）细胞。这些数据与 miR-135 抑制影响培养的 CRC 细胞系对化疗药物耐药性的观察结果一致。
虽然新陈代谢的改变早已被认为是癌症的一个核心标志，但最近的研究才开始着眼对 CRC 新陈代谢机制的理解。健康和癌症上皮细胞的代谢构成了饮食与宿主细胞的命运和表型之间的初始检查点，以及这些细胞与其他细胞和微环境的互动方式。此外，代谢重编程是一个受致癌基因支配的活跃过程，而肿瘤抑制因子在癌症的发生和塑造结直肠癌细胞对化疗的反应方面至关重要。因此，研究肠道肿瘤和邻近健康组织中组织学上的代谢变化的意义和机制十分重要。该研究确立了 miR-135 在调节 SPOCK1 稳态活性中的关键作用，以促进小鼠 PO 和人类 tPDO 中的癌症表型。因此，突出了靶向 miR-135/SPOCK1 以增强结直肠癌治疗的潜力。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41389-021-00376-1
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