多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome, PCOS）是育龄妇女的一种内分泌疾病，主要特征是慢性无排卵、多囊卵巢形态和高雄激素血症。卵泡微环境对于卵泡发育、卵母细胞成熟和质量至关重要。据报道，卵母细胞和周围的颗粒细胞（Granulosa cell, GC）在卵泡发育阶段通过直接间隙连接显示出相互依赖的关系。研究还发现，在卵泡液微环境中 GCs 和卵母细胞之间通过旁分泌或自分泌的方式进行营养交换和生物信号传递，从而调节卵泡的生长、发育和成熟。因此，GCs 的失调会影响卵巢卵泡微环境，这可能会损害卵泡生成，随后影响多囊卵巢综合症患者的。因此，探索 GCs 的功能可以解释 PCOS 患者的卵泡发育异常。
越来越多的证据表明，源自患者卵泡液（follicular fluid, FF）的外泌体 miRNA 在 PCOS 中发挥着关键作用。然而，哪些来自卵泡液的外泌体 miRNAs 在控制颗粒细胞功能中发挥了关键作用，以及其潜在机制在很大程度上仍是未知的。此外，PCOS 患者的卵母细胞凋亡率明显高于健康对照组。而GCs 异常凋亡的内在机制也仍不清楚。
2022 年 3月 14 日，河北医科大学附属妇产科医院生殖医学中心的研究人员在 Scientific Reports 杂志上发表了题为“来自卵泡液的外泌体 miR-143-3p 通过靶向多囊卵巢综合征中的 BMPR1A 促进颗粒细胞凋亡”的研究论文。该研究表明 miR-143-3p 在多囊卵巢综合症患者的卵泡液外泌体中高度表达，并能被输送到颗粒细胞中。在机制上，BMPR1A 被确定为 miR-143-3p 的直接靶标。BMPR1A 的过量表达通过激活 Smad1/5/8 信号通路逆转了外泌体 miR-143-3p 对 GC 凋亡和增殖的影响。这些结果表明，来自 PCOS 卵泡液的含 miR-143-3p 的外泌体通过靶向 BMPR1A 和阻断 Smad1/5/8 信号通路促进颗粒细胞凋亡。该研究为多囊卵巢综合症治疗策略的发展提供了理论支持。
从健康对照组和多囊卵巢综合症患者的卵泡液中分离出外泌体，并进行了表征。TEM 分析显示，来自 PCOS 患者 FF 的外泌体是直径为 30-150 nm 的圆形膜结合囊泡，与对照组的外泌体一致（图 1A）。Western blotting 显示，外泌体标志蛋白 TSG101 和 HSP70 在这些外泌体中富集（图 1B），与预期一致。为了进一步确认 FF-外泌体是否可以被原代 GC 或 KGN 细胞吸收，研究人员用 PKH67 荧光染料标记 FF-外泌体，然后将它们与原代 GC 或 KGN 细胞共孵育 12 h。免疫荧光染色显示，PKH67 标记的外泌体被原代 GC 或 KGN 细胞有效吸收并转移至细胞质区室（图 1C、1D）。总体而言，这些结果表明，FF-外泌体可以被原代 GC 或 KGN 细胞成功分离和内化。
图1. 来自人类卵泡液的外泌体的分离和鉴定。
为了确定 PCOS-FF 衍生的外泌体对 GC 凋亡和增殖的功能作用，研究人员分别用正常-FF 衍生的外泌体和 PCOS-FF 衍生的外泌体培养原代颗粒细胞和 KGN 细胞 48 h。如图 2A、2B 所示 ，在暴露于 PCOS-FF 衍生的外泌体的 GCs 中，促凋亡基因 Bax 的 mRNA 和蛋白质表达水平上调，而抗凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 和蛋白质表达水平下调。正如预期的那样，PCOS-FF 衍生的外泌体处理组中原代 GC 和 KGN 细胞的凋亡率显著提高（图 2C，2D）。接着，通过 CCK8 测定进一步评估了 PCOS-FF 衍生的外泌体对体外颗粒细胞增殖的影响。与 PBS 和正常-FF 衍生的外泌体处理相比，PCOS-FF 衍生的外泌体处理显著抑制了原代 GC 和 KGN 细胞的生长能力（图 2E，2F）。总之，这些研究结果表明，PCOS-FF 衍生的外泌体促进颗粒细胞的凋亡并抑制其增殖。
图2. PCOS-FF 外泌体加速颗粒细胞凋亡并抑制细胞增殖。
先前的研究表明，血清、卵泡液和颗粒细胞释放的大量微囊泡，其中含有编码和非编码 RNA，包括具有多种功能特性的 miRNAs。研究人员假设 PCOS-FF-外泌体可能通过转移特定的 miRNA 来增强颗粒细胞的凋亡。于是筛选了正常人群和 PCOS 患者的卵泡液衍生外泌体中差异表达的 miRNAs，发现 miR-143-3p 在 PCOS-FF 的外泌体中富集，通过 qRT-PCR 分析检测正常-FF外泌体和PCOS-FF外泌体中miR-143-3p的表达水平证实了这一结果（图 3A、3B）。此外，与 PBS 和正常-FF 外泌体相比，用 PCOS-FF 外泌体处理的原代颗粒细胞和 KGN 细胞中 miR-143-3p 水平显著增加（图 3 C、3D）。因此，这些结果表明 miR-143-3p 在 PCOS-FF 衍生的外泌体中富集。
图3. miR-143-3p 在 PCOS-FF 衍生的外泌体中富集，但在正常-FF 衍生的外泌体中不富集。
为了进一步阐明 miR-143-3p 在颗粒细胞凋亡和增殖中的生物学作用，将 miR-143-3p 模拟物或抑制剂转染到 KGN 细胞中。与预期一致，miR-143-3p 模拟物显著增加了 miR-143-3p 的表达，而 miR-143-3p 抑制剂降低了其在 KGN 细胞中的表达（图 4A）。Western blotting 结果显示，促凋亡基因 Bax 的蛋白水平在转染 miR-143-3p 模拟物后显著升高，在转染 miR-143-3p 抑制剂后显著降低。而抗凋亡基因 Bcl-2 的蛋白水平在 miR-143-3p 模拟转染后显著降低，在 miR-143-3p 抑制剂转染后显著升高（图 4B）。细胞凋亡测定显示 miR-143-3p 过表达显著促进细胞凋亡，而 miR-143-3p 抑制则显示出抗凋亡表型（图 4C，4D）。此外，CCK8 测定显示 miR-143-3p 过表达显著抑制细胞增殖，而 miR-143-3p 抑制会增强细胞增殖（图 4E，4F）。这些结果表明，PCOS-FF 衍生的外泌体 miR-143-3p 在增强颗粒细胞凋亡和减少增殖方面起着至关重要的作用。
图4. 外泌体 miR-143-3p 促进 KGN 细胞的凋亡并抑制生长。
为了进一步阐明 miR-143-3p 影响颗粒细胞功能的机制，研究人员使用在线生物信息学预测软件搜索了 miR-143-3p 靶基因。结果表明，在 BMPR1A 的 3'UTR 中发现了 miR-143-3p 的结合序列（图 5A）。BMPR1A 是一种骨形态发生蛋白受体激活素样激酶，是 BMP 信号通路中的一个关键信号分子，在细胞周期、增殖、凋亡和其他细胞过程中起关键作用。因此，推测 BMPR1A 可能是 miR-143-3p 的直接靶基因。接着，检测了对照组和 PCOS 患者之间 GCs 中 BMPR1A 的 mRNA 表达，结果显示 PCOS 患者原发性 GCs 中 BMPR1A 的 mRNA 表达低于对照组。随后，应用双荧光素酶报告基因测定来验证它们的相互作用。构建 PGL-3-BMPR1A-wt 和 PGL-3-BMPR1A-mut 质粒并与 miR-143-3p 模拟物共转染到 KGN 细胞中。结果显示，在共转染了 miR-143-3p 模拟物和野生型BMPR1A 3'UTR Reporter 的 KGN 细胞中，荧光素酶活性降低，而在共转染了 miR-143-3p 模拟物和突变型 BMPR1A 3'UTR Reporter 的 KGN 细胞中没有发现荧光素酶活性变化（图 5B）。
图5. BMPR1A 是 miR-143-3p 的直接靶基因。
为了研究 BMPR1A 和 miR-143-3p 之间的关系，检测了用 miR-143-3p 模拟物或抑制剂转染的 KGN 细胞中的 BMPR1A mRNA 和蛋白质表达。如图 5C、5D 所示，BMPR1A 的 mRNA 和蛋白质表达因 miR-143-3p 模拟物转染而降低，因 miR-143-3p 抑制剂转染而增加。这些数据表明 BMPR1A 是 miR-143-3p 的一个直接靶标。
为了探究 BMPR1A 是否参与 miR-143-3p 对细胞表型的调节，研究人员在 KGN 细胞中共转染了 miR-143-3p 模拟物和 pcDNA-BMPR1A 质粒。细胞凋亡和 CCK8 检测表明，与单独转染 miR-143-3p 模拟物相比，miR-143-3p 模拟和 BMPR1A 表达质粒的联合转染能够抑制细胞凋亡并促进细胞增殖（图 6A，6B）。这些数据表明 BMPR1A 介导了 miR-143-3p 在 KGN 细胞中促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用。
图6. miR-143-3p 通过抑制 BMPR1A/Smad1/5/8 信号通路促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。
之前的研究表明，Smad1/5/8 是 BMPR1A 的下游信号分子，调节细胞增殖和凋亡。因此检测了 miR-143-3p 对 BMPR1A 的下调是否影响下游信号，包括 Smad1/5/8 及其磷酸化。如图 6C 所示，miR-143-3p 的过表达显著降低了磷酸化 Smad1/5/8 的活性，同时伴随着促凋亡蛋白 Bax 的增加和抗凋亡蛋白 Bcl-2 的减少。然而，与单独使用 miR-143-3p 模拟物相比，用 miR-143-3p 模拟物和 BMPR1A 表达质粒共同处理更能够逆转 p-Smad1/5/8 和抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达。此外，BMPR1A 的过表达抑制了由 miR-143-3p 触发的促凋亡蛋白 Bax 的表达。这些结果表明，BMPR1A/Smad1/5/8 信号通路介导了 miR-143-3p 对 KGN 细胞凋亡和增殖的作用。
卵泡液为卵泡发育和卵母细胞成熟提供了重要的微环境。卵泡液外泌体可以传递参与卵泡发育和卵母细胞成熟的 miRNAs、mRNAs 和蛋白质。先前的研究表明，源自人类卵泡液的外泌体中的 miRNA 在类固醇生成中起关键作用，并且与 PCOS 密切相关。然而，卵泡液外泌体 miRNAs 在 PCOS 的病理过程中，尤其是在卵泡发育过程中的机制尚不清楚。在该研究中，从 PCOS 患者和健康对照者中分离和表征了 FF 衍生的外泌体，并鉴定了其中的 miRNA 表达谱，通过对比发现 miR-143-3p 富集在 PCOS-FF 外泌体中。通过实验发现过表达 miR-143-3p 显著提高了 GCs 的凋亡率，同时抑制了细胞增殖，推测 PCOS-FF 外泌体可能通过转移 miR-143-3p 影响颗粒细胞的凋亡。
总之，该研究首次揭示了来自 PCOS 卵泡液的含有 miR-143-3p 的外泌体通过靶向 BMPR1A 并阻断 Smad1/5/8 信号通路促进颗粒细胞凋亡。这些发现为 PCOS 中的 GC 功能障碍提供了新的见解，并表明来自 PCOS 患者卵泡液的外泌体-miR-143-3p 可能是治疗 PCOS 的有希望的分子靶标。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41598-022-08423-6
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