B 细胞淋巴瘤，包括慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL），是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）中最常见的亚型，其特点是 B 细胞受体（B-cell receptor, BCR）信号的慢性激活。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase, BTK）抑制剂（BTKi）已在新诊断和治疗复发/难治性 CLL 和许多 NHL 亚型患者中显示出令人印象深刻的临床活性，但随着时间的推移，许多接受 Ibrutinib（FDA 批准的口服 BTK 抑制剂）治疗的患者会复发或产生耐药性。
Acalabrutinib 是 FDA 批准的第二代、高选择性、强效、共价 BTK 抑制剂，具有最小的脱靶效应，在初治、复发/难治性 CLL 患者中显示出良好的耐受性和疗效。与 Ibrutinib 相比，具有相似的临床活性，但安全性有所提高。之前的研究表明对 Ibrutinib 的获得性耐药与肿瘤抑制蛋白 PTEN 的下调和 PI3K/AKT 通路的激活有关。然而，PTEN 如何介导 B 细胞恶性肿瘤中对 BTK 抑制的抗性尚不清楚。
2021 年 11 月 8 日，美国俄亥俄州克利夫兰勒纳研究所的研究人员在 Cell Death & Disease 杂志上发表了题为“协同 miRNA 依赖性 PTEN 调节驱动 B 细胞淋巴恶性肿瘤对 BTK 抑制的抗性”的研究论文。该研究展示了 BTKi ibrutinib 和 acalabrutinib 下调位于 14q32 miRNA 簇区域的 miRNA，包括 miR-494、miR-495 和 miR-543。BTKi 抗性 CLL 和 DLBCL 细胞显著过表达 miR-494、miR-495、miR-543，并降低 PTEN 表达，表明 PI3K/AKT/mTOR 通路在获得性 BTKi 抗性中得到进一步调节。此外，miR-494 模拟物的过表达降低了 PTEN mRNA 和蛋白质水平，进一步表明 PTEN/AKT/mTOR 对细胞凋亡的调节。相反，在 BTKi 抗性细胞中过表达 miR-494 抑制剂可恢复 PTEN mRNA 和蛋白质水平，从而使细胞对 BTKi 诱导的细胞凋亡敏感。因此，靶向 14q32 簇 miRNA 可能通过调节 PTEN/AKT/mTOR 信号轴对获得性 BTK 耐药患者具有治疗价值。
通过体外培养亲本细胞系时用逐渐增加浓度的 acalabrutinib 或 ibrutinib 处理产生 Aca-R ABC-DLBCL（TMD8）、IB-R ABC-DLBCL（RIVA，TMD8）和CLL（MEC-1）细胞系。细胞活力分析显示，在 acalabrutinib 处理 24 h 后，TMD8 的细胞死亡增加了约 40%（图1a），但Aca-R（acalabrutinib-resistant）-衍生细胞没有。同样，MTS 检测显示对增加浓度的 acalabrutinib 的敏感性很高。免疫印迹分析表明，与亲本细胞相比，抗性细胞（TMD8-Aca-R）中 PTEN 的水平较低（图1b）。此外，与亲本细胞相比，TMD8-Aca-R 中 pAKT（AKTSer473）的水平上调。而 pBTK（BTKY223）的水平降低了，表明长期的 acalabrutinib 处理阻断了 Aca-R 细胞中 BTK 的激活。值得注意的是，qRT-PCR 分析发现 pten mRNA 水平降低了约 4 倍，表明 PTEN 水平降低可归因于 pten mRNA 水平的降低（图1c）。总之，这些发现表明 PTEN/AKT 轴在介导 Aca-R 中的重要性。
图1. BTK 抑制下调 CLL 和 DLBCL 细胞中 14q32 簇区域的 miRNAs。
为研究对 BTK 抑制的耐药机制，研究人员检查了位于 14q32 簇的 miRNA 的表达模式，在之前发现这些 miRNA 与 CLL 和 DLBCL 中对 BCL-xL 抑制的耐药性有关。通过 qRT-PCR 分析检查位于 14q32 簇中的 9 种 miRNA 的表达模式，表明它们在 Aca-R、IB-R DLBCL 和 CLL 细胞系中的表达增加。在这些 miRNA 中，miR-494 和 miR-543 在 TMD8-Aca-R 细胞中的表达分别增加了~ 3 倍和 2 倍（图1d）。在 TMD-IB-R 中，miR-494、miR-495 和 miR-543 的表达分别增加了 ~ 4.8 倍、~ 3 倍和 ~ 2 倍（图1e），在 MEC-1-IB-R 中分别为 ~ 6 倍、4 倍和 5 倍（图1f），在 RIVA-IB-R 细胞中分别为 ~ 7.5 倍、4 倍和 5 倍（图1g）。总之，这些发现表明 14q32 簇 miRNA 的异常表达与 BTK 抑制的耐药性有关。
由于长期暴露于 acalabrutinib 或 ibrutinib，BTKi 耐药导致 14q32 簇 miRNAs 的表达增加，PTEN 水平降低。接下来研究了急性 acalabrutinib 和 ibrutinib 处理对 BTki 敏感的 ABC-DLBCL 和CLL 细胞中 14q32 簇 miRNAs 的影响。用 acalabrutinib 处理的亲本 TMD8 细胞显示出 14q32 簇 miRNAs 的下调，miR-494（~50%）、miR-495（~40%）和 miR-543（~30%）水平降低（图2a）。Ibrutinib 在 TMD8 细胞中对 BTK 的抑制导致 miR-494 和 miR-543 的表达降低约 90%，miR-495 的表达降低约 80%（图2b）。类似地，在 MEC-1（图2c）和 RIVA 细胞（图2d）中也观察到 miR-494、miR-495 和 miR-543 的表达降低了约 90%。总之，这些发现表明 14q32 簇 miRNA 的异常表达在介导 BTKi 耐药性方面具有潜在作用。
图2. CLL 和 DLBCL 中 BTK 抑制后 14q32 簇 miRNA 的表达降低。
鉴于体外 Aca-R 和 IB-R CLL 和 DLBCL 细胞中 14q32 簇 miRNAs 和 PTEN 表达的差异，接下来测试了 miRNA 表达是否也可能在患者来源的原发性 CLL 细胞中发生改变，以响应 BTK 抑制或标准的临床治疗。qRT-PCR 分析了临床上 ibrutinib 治疗前后的三对 CLL 患者样本，结果显示，临床治疗后 #CLL3（ibrutinib 敏感型）中 miR-494、miR-495 和 miR-543 的水平降低，与 #CLL1（ibrutinib 耐药型）和 #CLL2（部分缓解型）相反（图3a）。此外，ibrutinib 对 CLL 患者样本的体外处理显示，在治疗复发患者与初治患者中，miR-494、miR-495 和 miR-543 的表达增加（图3b）。而体外 acalabrutinib 处理初治（#CLL4, #CLL5）与治疗复发（#CLL6, #CLL7）的 CLL 患者，发现 #CLL4（2.9 倍）和 #CLL5（3.2 倍）的 pten mRNA 水平显著增加，与 #CLL6 和 #CLL7 相反（图3d）。综上，这些结果表明 14q32 簇 miRNAs 的异常表达在介导治疗抗性中发挥作用。
图3.在患者来源的原代 CLL 细胞中，BTK 抑制后 14q32 簇 miRNA 的表达降低，而 PTEN 的表达增加。
之前的研究表明，ibrutinib 治疗可调节 CLL 和 DLBCL 细胞中 PTEN 的转录激活。使用靶点预测软件来确定具有假定 PTEN 靶点的 miRNA，研究人员发现了 6 个位于 14q32 簇的 miRNA，其中 miR-494 的得分最高。对转染了 miR-494 抑制剂的 TMD8-Aca-R 细胞进行 qRT-PCR 和免疫印迹分析，发现 pten mRNA（上图）和蛋白（下图）的表达水平明显增加（图4a）。在 TMD8-IB-R（图4c）、MEC-1-IB-R 和 RIVA-IB-R 细胞中也得到类似的结果。为了证实 miR-494 直接参与 PTEN 的调控，加入 miR-494 模拟物导致亲代 TMD8（图4b）、MEC-1 和 RIVA 细胞中内源性 PTEN mRNA（上图）和蛋白（下图）表达水平均大幅下降。这些结果表明 PTEN 受 miR-494 的转录后水平调节，并且可能是直接靶标。
图4. PTEN 是 CLL 和 DLBCL 中 miR-494 的直接靶标。
为了确定 miR-494 的潜在靶标，研究人员使用 mirDB 对 14q32 miRNA 簇区域和 PTEN 3'-UTR 序列进行了预测分析。该分析在 PTEN mRNA 的 3'-UTR 的 2313 和 2798 处鉴定出了两个保守的互补序列，miR-494 可能与之配对（图4f）。为了研究 PTEN 是否是 miR-494 的直接靶标，将含有野生型（WT）PTEN 3'-UTR 或 miR-494 结合位点突变体 PTEN 3'-UTR 的荧光素酶报告基因与 miR-494 模拟物（图4e）或抑制剂（图4d）一起转染 TMD8 和 TMD8-IB-R 细胞，48 h 后测量荧光素酶活性。与阴性对照相比，TMD8 细胞中的异位 miR-494 模拟物的表达使 WT-3'-UTR 相关荧光素酶活性下调约 50%，而转染 mutant 3′-UTR 荧光素酶报告基因，miR-494 模拟物无法抑制荧光素酶活性（图4e）。相比之下，与阴性对照相比，在 TMD8-IB-R 细胞中用 miR-494 抑制剂转染完全逆转了荧光素酶活性，导致 WT-3'-UTR 相关荧光素酶活性增加 4 倍（图4d）。总之，这些结果表明 miR-494 与 PTEN 3'-UTR 中预测的和先前报道的靶点直接结合。
接下来研究了是否可以结合 miR-494 或 miR-495，通过 AKT 抑制使得这些细胞进一步对凋亡敏感。之前的研究已经表明 IB-R 细胞中的 AKT 激活升高，而 PTEN 显著下调，从而使 IB-R 细胞对通过 AKT 抑制诱导的细胞凋亡更敏感。对 AKT 的药理学抑制显示 TMD8-Aca-R 细胞的凋亡分别增加了 ~ 20% 和 ~ 19%，分别是通过 miR-494（图5a）或 miR-495（图5b）抑制 AKT，在 TMD8-IB-R 细胞中结果类似（图5c，5d）。这些结果共同表明 BTKi-R 细胞依赖 miR-494 或 miR-495 依赖性的 PTEN/AKT 调节，抑制 AKT 的磷酸化/激活会增加 miR-494 和 miR-495 抑制诱导的 BTK-R 细胞的凋亡。
图5. 在 BTK 抑制剂耐药的 CLL 和 DLBCL 中，miRNA 抑制增强了 AKT 诱导的细胞凋亡。
miR-494 抑制剂抑制了 AKT 和 mTOR 的活性，如 pAKT Ser473 的减少和 mTORC1、p70S6 Thr389 激酶和 p4EBP1 下游靶标磷酸化的抑制所示。值得注意的是，通过抑制 miR-494，TMD8-IB-R 细胞中 PTEN 蛋白水平的表达增加。然而，AKT 和 p70S6 激酶水平没有显著变化（图6a）。这些发现表明，TMD8-IB-R 细胞中响应于 miR-494 抑制的 PTEN 蛋白表达增加与 AKT 和 mTOR 活性降低有关。此外，miR-494 抑制导致 caspase 3 cleavage 的表达增加（图6a），抑制 miR-495 获得了类似的结果（图6b）。接下来，研究人员检查了这些 miRNA 是否可以通过调节 PTEN 表达协同影响细胞活力。在 TMD8-IB-R（图6c）和 MEC-1-IB-R（图6d）细胞中的细胞活力分析表明，与单独转染 miR-494 或 miR-495 抑制剂相比，在转染了 miR-494 和 miR-495 抑制剂组合的细胞中，细胞凋亡增加了约 20%，表明这些 miRNA 抑制剂对细胞存活具有协同作用。
图6. miR-494 和 miR-495 的协同抑制通过 AKT/mTOR 信号传导增强细胞存活。
尽管 B 细胞淋巴恶性肿瘤存在广泛的异质性，但越来越多的证据支持 miRNAs 表达失调与各种癌症（包括 CLL 和 DLBCL）治疗的耐药性之间存在关联。最近的发现表征了通过 PTEN 下调阻碍 ibrutinib 诱导的细胞凋亡的获得性耐药性的发展。该研究的发现为 BTK 抑制剂耐药机制提供了新的分子见解，并支持 Aca-R 和 IB-R 细胞中 14q32 簇 miRNAs 的异常表达与 anti-miR-494 或 miR-495 上调 PTEN 的能力之间的联系，以克服耐药性并通过减弱 AKT 的激活诱导细胞凋亡。因此，14q32 miRNA 簇/PTEN/AKT/mTOR 轴成为 CLL 和 DLBCL 中获得性 BTKi-R 的决定因素，将 miRNA 和 AKT 抑制组合作为一种合理的组合策略，使 BTKi-R 细胞对凋亡敏感，对于耐药性肿瘤的疗法开发意义重大。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-021-04353-9
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