药代动力学（pharmacokinetic, PK）参数的高质量评估对于药物发现过程中候选药物的选择和人体剂量的预测至关重要。药物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）是核心 PK 过程，需要对其进行优化以获得理想的临床暴露。通常将多种体外系统与基于生理的药代动力学（physiologically based pharmacokinetic, PBPK）建模相结合，用于 ADME 特性的实验评估和外推。以平板或悬浮形式培养的原代肝细胞通常用于测定代谢和转运蛋白介导的清除率、酶表型和代谢物鉴定。
然而，在体外建立测定仍然在定量转化方面存在差异，可通过引入新的细胞培养技术来解决。以二维形式培养肝细胞的一个局限性是在实验过程中酶活性的迅速丧失，这阻碍了对代谢清除的准确预测。其他方面的限制包括评估其他 ADME 相关的药物特性，如胆汁和窦道流出，药物转运体底物的主动吸收清除率在体外与体内的准确比例，预测代谢稳定的药物在体内的相关代谢物，以及可靠地预测时间依赖的抑制和诱导等。由此，微生理系统（Microphysiological systems, MPS）有望以更生理相关的方式解决更复杂的体外 ADME、毒理学和药理学问题，同时减少对动物试验的需求。
2022 年 1 月 25 日，罗氏制药的研究团队在 Lab on a Chip 杂志上发表了题为“探索和应用肝脏芯片，结合建模和模拟进行定量药物代谢研究”的研究论文。该研究使用集成了培养基流和肝细胞培养的 PhysioMimix 肝脏芯片，在体外研究候选药物的肝脏分布特征。研究展示了数学建模与实验肝芯片研究的集成，并证明了这种方法支持从复杂的体外细胞系统中生成高质量的数据，允许对不同复杂性的代谢模型进行客观评估。该研究使得临床开发之前对候选药物活性或毒性代谢物的检测更有信心。
PhysioMimix 肝芯片是一种微流体装置，能够对肝细胞进行连续灌注，通过介质流的剪切应力提供机械刺激，同时提供营养和氧气（图 1）。虽然与 2D 培养的肝细胞相比，肝脏芯片的细胞表型维持时间延长、代谢活性更高。但要将 MPS 集成到药物开发工作流程中仍需要验证平台是否满足 ADME 研究的最低要求。以肝芯片形式培养的细胞需要表现出生理相关且稳定的表型，此外，MPS 中生成的结果需要稳健且可重复。只有在证明了这些属性并进行了多种分子的更广泛的验证之后，才能考虑将该系统用于更复杂的研究。
图1. PhysioMimix 肝脏芯片简介图。
体外药物代谢研究主要探讨药物在细胞中的生物转化和运输。在这种情况下，肝细胞播种效率和细胞数量的量化是重要的评估，用以实现以细胞数量为标准的定量读数，如药物清除和代谢物形成率。为此，在接种平板的同时（第 - 4 天），对未使用的细胞进行计数，并在 7 次不同的情况下测定总肝细胞蛋白的量。其中 6 次蛋白质含量始终在每百万个细胞 1.015 和 1.078 mg 之间，线性回归显示总蛋白量和细胞数之间有很强的相关性（R2 = 0.995）（图 2A），与其他已发表结果一致。在第 2 天（即播种后 5 天），每个实验的对照孔（n = 15）的肝细胞数量平均为 260 000 ± 25 000（CV：9.3％）。将第 2 天在对照孔中测得的肝细胞数量与第 - 4 天最初播种的数量进行比较，显示平均播种效率为 52.0±7.1%（CV：14%）（图 2B）。实验中的播种效率比实验之间更一致。因此，使用为此目的保留的卫星孔为每个实验确定细胞数。考虑到普遍报道的清除率预测不足的问题，对实际细胞数的校正对于体内的定量可转化性具有重要意义。
图2. 播种效果和肝细胞数。
在非常低的药物浓度下，药物代谢率通常与药物浓度成正比，因此随着孵育时间的延长呈指数下降。内在清除率（CLint）是一个绝对测量参数，通过对药物浓度与孵化时间数据的指数衰减函数进行拟合而计算出来的，是不同体外系统之间或体外与体内数据比较和推断的首选参数。测定了四种细胞色素 P450（CYP）底物、七种 UDP-葡糖醛酸基转移酶（UGT）底物和一种醛氧化酶（AO）底物的内在清除率，以评估肝芯片系统中肝细胞培养物的代谢能力。图 3 显示了药物的介质浓度-时间曲线。计算出的细胞数的孔间变异性很低，平均 CV 为 12%（范围从 2% 到 21%）。
图3. 培养基中的药物浓度与孵育时间的关系图。
体外药物代谢研究监测淬灭培养物或培养基样品中的药物和代谢物浓度。从肝脏芯片系统的介质隔室中提取多个样本来创建体外 PK 曲线，并计算内在参数，如药物清除率。此外，具有高内在清除率的药物可能具有较短的体内半衰期和较低的生物利用率。使用肝细胞的传统药物代谢研究利用相对较短的培养时间和每个时间点的一个实验培养孔，用含有内标的有机溶剂将其全部淬灭。这种处理方式在很大程度上弥补了蒸发效应，因为在实验结束时，每个孔中的全部药物材料都需要被回收。相比之下，器官芯片系统可能有较少但较大的孵化室，可从中取出多个样品。因此，在实验中更多地考虑药物数量和浓度对药物代谢研究人员来说十分很重要。这里进行的肝脏芯片中的代谢评估将建模和模拟作为研究的一个重要部分，以便详细了解实验中发生的情况，并获得正确的内在清除率估计。
图4. 表示蒸发和取样对 PhysioMimix 肝脏芯片培养 96 h 的培养基体积、药物底物浓度、药物量和细胞与培养基比例的影响。
实验数据显示，在 4 天的培养过程中出现了显著的蒸发（> 20%）。在确定了肝脏芯片系统中的蒸发率和效应后，研究人员采用计算模型，应用计算机建模来评估蒸发对使用模拟数据估计的体外内在清除率准确性的影响（图 4）。为进行分析，使用蒸发模型在 CLint 和 kev 范围内模拟了理论浓度-时间曲线，与实验观察到的情况相符。随后，线性模型和蒸发模型都被用于评估模拟的浓度-时间曲线。图 5 显示了使用蒸发模型所解决的可能偏差。通过模拟实验，研究人员确定了 CLint 和 kev 在哪些情况下需要用更现实但也更复杂的蒸发模型来取代线性模型（图 5）。
图5. 使用线性模型（黑条）和蒸发模型（灰条）对预计的 CLint 进行计算机比较。
为了解当前系统的适用性和未来系统增强的目标，验证体外 CLint 数据对体内清除的可转化性至关重要。使用基于生理学的比例将使用肝芯片测量的 12 种化合物的估计 CLint 数据外推到体内肝清除率值。外推和观察到的肝脏体内 CLint 值的比较显示在图 6 中。分析中使用的 12 种底物中，有 7 种（咪达唑仑、奎尼丁、双氯芬酸、纳洛酮、奥沙西泮、甲苯磺丁脲和劳拉西泮）的肝脏固有清除率预测值在观察数据的 3 倍以内。特别是，对于通过代谢过程从体内清除的渗透性较强的化合物，该预测结果令人满意。分析结果表明，CYP 和 UGT 底物之间的预测成功率并无差异。
图6. 用肝脏芯片测试的 12 种化合物的 CLint IVIVE，并与观察到的肝脏清除率进行比较。
将微生理系统用于制药行业的候选药物优化和选择，需要对其进行测试，以确定细胞性能、与药物分子一起使用的适用性以及对拟议应用的验证。研究表明，使用白蛋白等生物标志物测定接种效率和量化活性细胞数量对于定量理解该系统至关重要。在通过了基本的系统适用性评估后，进行了更高级的研究，以探索该系统在 DMPK 研究中的优点。对数据进行数学建模，通过考虑介质随时间变化的相关蒸发，可以获得更准确的结果，并能同时确定清除率和代谢率的数值。将体外清除率外推至体内的研究，表明该系统已经提供了合理的人类可转化性。该研究探索了肝脏芯片的优化道路，并强调了与制药行业药物代谢环境相关的一些验证目标和方法，对于未来对肝脏芯片的调整方向具有指导意义。
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/lc/d1lc01161h
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