使患者来源的干细胞的 3D 细胞培养是更有效和个性化的癌症治疗必不可少的体外模型，了解和标准化细胞微环境是成功体外模型的关键。目前，培养条件和代谢物浓度控制，尤其是缺氧，通常无法在微生理系统内连续和原位实现。此外，将微传感器集成到用于动态的、基于基质的 3D 细胞培养平台中是相当具有挑战性的。必须形成可靠的细胞装载凝胶集成的隔间，必须提供动态的、可靠的和有效的流体通道来为细胞提供培养基，并且必须通过集成传感器或微流控技术从异质培养物中提取有意义的测量信号。
2021 年 12 月 1 日，弗赖堡大学微系统工程系领导的研究团队在 Lab on a Chip 杂志上发表了题为“用于三维细胞培养物中代谢物多重分析的微流控器官芯片系统”的研究论文。该研究开发了一种微流体器官芯片平台，用于基于基质的异质 3D 培养，具有完全集成的电化学和生物传感器阵列，用于能量代谢物氧、乳酸和葡萄糖测定。该研究强调了持续、3D 细胞培养中的原位代谢物监测，涉及培养条件的标准化和控制，以及癌症研究中的药物筛选，展示了微传感器在器官芯片系统中成功应用的潜力。
该系统的流体单元使用微加工工艺放置在 16.2 × 10.6 mm2 Pyrex 硼硅酸盐玻璃芯片上，由两个 1.4 μl 细胞隔室组成，周围环绕着三个 500 μm 宽的微通道（图 1a）。该芯片系统的制造从 500 μm 厚的 4 英寸 Pyrex 硼硅酸盐玻璃晶片开始（图 1c）。首先，使用等离子体增强物理气相沉积（plasma enhanced physical vapour deposition, PECVD）在晶片上涂覆 500 nm 氮化硅绝缘层。将图像反转抗蚀剂 AZ 5214E 旋涂至 1.4 μm 的厚度，并通过 UV 光与掩模对准器 MA6B 使用铬掩模进行图案化。随后，使用 50 nm 钛作为粘附促进剂，100 nm 铂作为电极材料和 20 nm 钛作为覆盖层，在剥离工艺中蒸发和结构化。在进一步的 PECVD 步骤中，晶片表面被覆盖上 800 nm 氮化硅和 200 nm 的氧化硅的绝缘叠层。通过预先图案化的 AZ 1518 阳性抗蚀剂掩模的反应性离子蚀刻（Reactive ion etching, RIE）来打开晶片上接触垫和电极所在区域的绝缘层和钛层。
图1. 微流体器官芯片的系统设计、配置和微制造。
该平台的流体壁、屏障结构和电极边缘是使用永久性负环氧抗蚀剂 SU-8 3000 作为结构材料形成的（图 1c，1d）。复杂的结构是通过两个不同的铬掩模对多个 SU-8 层进行 365 nm UV 光曝光而创建的。最后的制造步骤是将计算机数控铣削的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖板（2 mm 厚）永久连接到流体单元（图 1b，1c）。盖子包含所有流体入口和出口端口，并将立体显微镜手动放置在流体壁上。系统组件之间通过填充生物相容性环氧基粘合剂并在室温下固化 24 h 来连接。
芯片的布局允许在两个球状体隔室中生成不同的微环境，以及通过引导液体流向特定的通道来控制嵌入细胞之间的通信。为了说明系统的功能，图 2 显示了两种可能的操作模式以及微流体操作下的电化学测量，其中每种模式按顺序执行。磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的过氧化氢（H2O2）因作为反应性物质出现并且在扩散方面的行为类似于氧气，被用作这些扩散分析的测试物质。
图2. 物质运输控制研究。以 PBS 中的 H2O2 作为测试物质，使用位于每个微通道中心的微传感器进行测量。
图 2a 显示了第一种操作模式，其中两个外部通道保持静止，而中间通道被灌注。由于芯片的轴对称，使得物质均匀分布到两个球状体隔室中。根据所用水凝胶内单个溶质的扩散率，浓度梯度从芯片的中心到外壁发展，这一点在电化学测量中得到了证明。因此，该平台展示了综合传感器测量能够评估器官芯片装置的物质运输。
图 2b 显示了第二种操作模式，通过一个外部通道确保营养和氧气供应，其他两个通道保持静止无流动。因此，浓度梯度范围遍及芯片的整个宽度。此外，隔室之间的通信可以通过信号分子通过静态中间通道的扩散而发生。向该通道施加流动会导致连通中断，并使两个隔间的流体隔离。在此，展示了通过区室化和微流体技术成功操纵物质运输，从而成功控制了培养条件。
所应用的安培氧气传感器的原理是氧气在铂金表面的电化学还原，因此，浓度变化是通过测量到电极的传质变化来确定的。为此，应用了优化的计时安培协议（图 3a），基于铂电化学的独特特性。图 3a 显示了在大气和缺氧条件下氧气浓度的典型电流响应。无氧条件下，传感器的输出接近于零，可以进行单点校准。将约 20 μm 厚的基于 pHEMA 的扩散限制膜分配到传感器电极周围的 SU-8 聚合物边缘（图 1c），以便在电极上方获得定义的扩散曲线，从而提高传感器响应的稳定性。
图3. 介质流以10μl min-1的速度进入中间通道。两个外部通道都保持静止。
通过循环形成和去除氧化层，电极在测量过程中得到永久清洁。如图 3b 所示，导致传感器具有非常高的长期稳定性，即使在含有蛋白质的细胞培养基中也没有可测量的漂移。连续操作 8 天以上，灵敏度没有变化。这些结果强调了稳定的电化学协议和膜对电极的保护，成功地防止了电极污染和阻塞物质的附着。此外，灵敏度可以通过膜厚度进行调整。所有电极的检测限均低于 1 μM（基于空白的3 σ）。测量点的低标准偏差表明平台内氧气浓度的测量具有高度可重复性。
该研究中使用的细胞模型由三阴性乳腺癌干细胞组成，更具体地说是乳腺癌干细胞系 1（breast cancer stem cell line 1, BCSC1），它是从个体患者的原发性侵袭性肿瘤中分离出来的五种广泛表征的 BCSC 系之一，它们被认为是癌症转移和治疗耐药性的原因。图 4a 显示了在动态流体操作下，细胞培养液通过芯片的中间通道灌注，经过四天的培养，单个 BCSC1 细胞发育成平均直径约为 50 μm 的球状体。通过不同接种密度的变化，发现最佳播种密度为每毫升0.5 × 106和 2 × 106 个细胞，可致每个平台的总细胞数达到 3500 至 15000 个细胞。由于沿中央通道轴对称，在两个细胞室中形成相同的浓度梯度，如图 2a 所证实。因此，A 室和 B 室中的球体在生长过程中经历相同的培养条件，并且在大小或数量上没有差异（图 4b，4c）。
图4. 片上肿瘤球状体的形成。
此外，芯片上生长的球状体具有与标准孔板格式相同的形态和大小分布（图 4c）。从 ECM 包埋的单个细胞发展为球状体的典型培养，与使用微流体结构和技术从确定数量的细胞聚集形成单个球体的方法相比，球体尺寸分布的变化范围更广。为了研究具有均匀尺寸分布或更大直径的球状体以获得更高的代谢活性，球状体还可以在平台外生长，通过具有确定网孔尺寸的细胞过滤器进行分类并转移到平台中。
图 5 显示了位于灌注通道中心的氧气传感器的信号，它位于两个细胞区间之间。在生长过程中，培养基通过平台以停止/流动的循环方式被吸入，每个阶段持续 30 min。在停止阶段，具有大气氧浓度的培养基的主动供应被停止，随之芯片内氧浓度的变化完全由细胞引起，并随着时间的推移呈现稳定下降（图 5b）。在流动阶段，向细胞重新供应富氧培养基，其以 2 μl min-1的速度通过传感器，使其信号恢复至基线。由于信号与流量相关的偏移叠加，传感器显示出的氧气浓度比大气条件下预期的要高。
图5. 在线氧气监测。
随着时间的推移，由于形成球状体的细胞数量的增殖和指数增长，细胞的需氧量增加。这也反映在培养时间过程中停止阶段氧浓度的降低（图 5a）。3.75 天后，所有可用的氧分子在停止阶段都被代谢，这代表了大气条件的 1.5% 与校准期间缺氧条件下的传感器输出相匹配（图 3a）。耗氧量增加，翻倍时间为 21.7 h（图 5c）。培养 4 天后，将 100 μM 抗霉素 A 添加到细胞培养基中，使氧气浓度突然升高至大气条件。由于抗霉素 A 抑制线粒体的电子传递，细胞的有氧代谢受到抑制，表现为耗氧量的急剧下降。细胞对药物的反应发生在 1 小时的停止/流动周期内（图 5a）。通过将氧传感器集成到这种动态细胞培养系统的灌注通道中，可以监测流入培养基的氧浓度。同时，可以非常准确地确定耗氧率，并用于揭示药物对呼吸代谢的影响。
前面的例子涵盖了系统培养基供应通道内的氧气浓度变化，图 6a 显示了在靠近球状体的球体隔室中心的长期氧气测量。通过整合到细胞室中，传感器的信号不受流量的影响，即使在流动阶段也能显示细胞所经历的实际氧气浓度。在培养的前三天，流动阶段重新建立了 19.9% 氧气的条件。此后，由于细胞的高吸氧量，不再达到该基线，如图6b所示，其中总结了各天结束时的停止/流动部分。这一观察结果强调了在细胞嵌入 ECM 内定位传感器进行氧监测的重要性，使得即使在活性培养基灌注期间也能获得细胞所经历的真实培养微环境。
图6. 长期氧气监测。
生物传感器基于在 pHEMA 的水凝胶内葡萄糖或乳酸等摩尔转化为 H2O2 的过程，该水凝胶固定在电极上并分别捕获葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。然后通过在0.5 V Ag/AgCl 电位下形成的 H2O2 的氧化电流密度来确定分析物的浓度。图 7a 和 7b 分别显示了葡萄糖和乳酸传感器的校准。通过改变膜堆内限制扩散膜的高度，可以针对所需应用调整灵敏度、检测限和线性范围。在每次实验之前和之后进行单独校准。图 7c 和 7d 显示了球状体培养过程中典型的生物传感器信号。由于 MSC 培养基中的高葡萄糖背景浓度和细胞乳酸分泌，两种分析物始终存在并被酶膜转化。这导致了 H2O2 在传感器电极上的积累和在停止阶段的信号增加。
图7. 生物传感器表征和长期测量。
关于葡萄糖消耗（图 7e）与乳酸产量（图 7f）的比率，观察到比 1:2 比例略低的葡萄糖消耗。与乳酸相比，葡萄糖的扩散速度较慢，因为它是较大的分子，葡萄糖由培养基提供，而乳酸仅由细胞产生。在停止阶段，培养基与凝胶隔室的交换仅发生在凝胶边缘附近。因此，该研究的葡萄糖测量值可能略微低估了细胞的实际消耗，但对两种代谢物浓度的定量比较还是可能的。此外，该研究首次证明，使用位于细胞培养区域外的生物传感器，可以对基于异质基质的培养物的这些参数进行定量和在线片上测量。
该研究开发了一种带有集成电化学微传感器阵列的微流控器官芯片平台，用于从单个干细胞开始进行基于基质的类器官培养，以实时获取相关代谢参数。所开发的透明技术基于玻璃芯片上先进的、模块化微流控单元的多层微加工工艺。任何基于基质的培养都可以通过简单的、屏障结构引导的微升级细胞隔室的填充与标准实验室设备进行集成。将单个三阴性乳腺癌干细胞引入低容量的微系统，可从不到 15000 个细胞中产生异质球状体培养，这些来自病人的干细胞在体外再现了病人的肿瘤，是测试药物疗效和对个体化化疗耐受性的理想模型。集成传感器可以提供关于培养条件和细胞代谢的重要实时信息，对于开发个性化治疗方案至关重要。
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/LC/D1LC00689D
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